Eksplorasi berbagai energi alternatif dari sumber daya alam yang dapat diperbaharui perlu dikembangkan. Sudah waktunya ketergantungan kebutuhan energi fosil non-renewable digantikan dengan energi renewable. Bioetanol menjadi pilihan utama karena mudah terurai dan aman bagi lingkungan karena tidak mencemari air dan hasil pembakarannya hanya menghasilkan karbondiokasida dan air. Rumput laut jenis Eucheuma cottonii dapat dijadikan sebagai sumber bahan baku utama dalam pembuatan bioetanol. Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui pengaruh konsentrasi inokulum asosiasi mikroba, waktu fermentasi dan penentuan kadar etanol dalam produksi bioetanol dari rumput laut Eucheuma cotonii. Proses hidrolisis yang mengkonversi lignoselulosa dari rumput laut Eucheuma cotonii menjadi bioetanol dilakukan dengan menggunakan mikroba asosiasi yaitu ; Aspergillus niger, Zymomonas mobilis dan Sacchoromyces cerevisiae secara serempak. Metode penelitian yang dilakukan adalah variasi konsentrasi inokulum 5 mL; 10 mL; 15 mL; 20 mL; 25 mL dan waktu fermentasi 0 hari, 4 hari, 5 hari, 6 hari, 7 hari, 8 hari. Konsentrasi bioetanol hasil fermentasi yang tertinggi adalah 5,65% pada konsentrasi inokulum 15% dan waktu fermentasi 7 hari.