Introducción. Microorganismos patógenos como Enterobacter cloacae producen enzimas β-lactamasas que les confieren resistencia a los antibioticos β-lactámicos y actualmente se ha identificado la actividad limitada de los inhibidores enzimáticos, de modo que las únicas posibilidades para enfrentar la problemática son el diseño de nuevos fármacos y el uso racional de los mismos. Objetivo. Evaluar el efecto de la chalcona dihidroxifenilpropenona sobre un aislamiento clínico de E. cloacae y sobre la enzima β-lactamasa aislada a partir de este microorganismo resistente como un aporte hacia la búsqueda de compuestos inhibidores de β-lactamasa. Materiales y métodos. Se sintetizó la chalcona dihidroxifenilpropenona y se evaluó sobre el aislamiento clínico de E. cloacae para determinar la concentración mínima inhibitoria mediante el método de microdilución en caldo y con la β-lactamasa purificada mediante cromatografía de afinidad se realizaron estudios espectrofotométricos de cinética enzimática. Resultados. La concentración mínima inhibitoria de la dihidroxifenilpropenona sobre E. cloacae fue de 35 μg/ml, el porcentaje de recuperación de la enzima β-lactamasa a partir del microorganismo fue de 31,75% y en el estudio cinético se evidenció actividad inhibitoria de acuerdo con los parámetros cinéticos de Vmax= 1,7 x 10-3 μM/min y KM´= 2330 μM. Conclusión. La chalcona dihidroxifenilpropenona ejerce su actividad inhibitoria a través de la interacción con la enzima β-lactamasa y de esta manera protege la integridad estructural de los antibióticos β-lactámicos, este efecto sinérgico lo convierte en un compuesto promisorio en la búsqueda de alternativas para enfrentar la problemática de resistencia bacteriana.