Introducción. La fiebre amarilla es una fiebre hemorrágica viral inmunoprevenible que continúa causando importante morbilidad y mortalidad en regiones tropicales y subtropicales. En Colombia hay aproximadamente cinco millones de personas en riesgo de adquirir la infección. Objetivo. Describir la importancia de los análisis serológicos, moleculares y virológicos en la vigilancia de la fiebre amarilla en Colombia, con base en los resultados obtenidos de muestras recibidas en el Laboratorio de Arbovirus del Grupo de Virología del Instituto Nacional de Salud, entre 2006 y 2008, y recalcar la relevancia de una oportuna y adecuada recolección de muestras para la confirmación de casos. Materiales y métodos. Se procesaron 2.096 muestras de suero y tejidos utilizando las pruebas ELISA para IgM contra fiebre amarilla, aislamiento viral-inmunofluorescencia indirecta y transcriptasa inversa-reacción en cadena de la polimerasa. Las muestras positivas se correlacionaron con los hallazgos clínicos y epidemiológicos para su interpretación y confirmación. Resultados. El 82% de los casos confirmados por histopatología en este período también se confirmaron en nuestro laboratorio por técnicas serológicas y moleculares; estos casos provenían de zonas selváticas y del piedemonte de la Cordillera Oriental. Conclusión. Se observa la necesidad de seguir manteniendo y fortaleciendo los procesos de vigilancia en las regiones de mayor circulación del virus, para la captación oportuna de casos. Se recalca la importancia del diagnóstico por medio de las técnicas descritas, las cuales se pueden realizar en muestras de pacientes vivos, contrario a las pruebas histopatológicas que requieren muestras de casos fatales.