Desenvolveu-se uma PCR multiplex (mPCR) para diagnóstico diferencial de encefalite bovina causada por herpesvírus suíno 1 (SuHV-1), herpesvírus bovino 1 (BoHV-1), herpesvírus bovino 5 (BoHV-5) e herpesvírus ovino 2 (OvHV-2). Os iniciadores foram projetados após alinhamento de sequências disponíveis no banco de genomas (GenBank) e a reação foi padronizada levando-se em consideração a concentração dos reagentes e os tipos diferentes de DNA polimerase. Após determinação da especificidade e sensibilidade, 65 amostras de encéfalo de bovinos com síndrome neurológica foram submetidas à análise. A sensibilidade analítica para detecção de BoHV-1, BoHV-5 e SuHV-1 foi, respectivamente, 10(1,2) TCID50/50µL, 10(1,0) TCID50/50µL, 10(1,3) TCID50/50µL na reação multiplex. Das 65 amostras analisadas, 10 foram positivas para BoHV-5, uma para BoHV-1 e cinco para OvHV-2. A mPCR descrita neste trabalho mostrou-se uma técnica útil para o diagnóstico diferencial de enfermidades relacionadas ao sistema nervoso central de bovinos.