Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui variasi genotip dan jarak genetik sapi Madura di Kabupaten Sampang dan Balai Besar Inseminasi Buatan (BBIB) Singosari berdasarkan teknik RFLP. Digesti DNA genom dengan enzim EcoRI dan PstI menghasilkan fragmen DNA dengan ukuran yang bervariasi baik pada induk, pedet, dan pejantan unggul dengan kisaran antara 10000 bp sampai 980 bp dan 10000 bp sampai 1250 bp. Analisis MVSP1 dengan metode UPGMA untuk jarak genetik ditemukan bahwa sampel sapi Madura berada dalam 2 cluster dan 1 outgroup. Persentase jarak genetik berada pada rentangan 0 sampai 25%.   (Kata kunci: Variasi genotip, Jarak genetik, Sapi Madura, RFLP)